Частые вопросы

На чем основан принцип метода MALDI Biotyper?

MALDI Biotyper– программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-ToF масс-спектрометров серии FLEX производства Bruker (например, Microflex, Autoflex ).

 

Метод выявляет уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов – своеобразный «отпечаток пальца». Идентификация микроорганизма происходит в основном по рибосомальным белкам, которые встречаются во всех микроорганизмах.

 

Биоинформационная модель, основанная на анализе белков, позволяет надёжно и точнопроводить идентификацию конкретного микроорганизма до вида путём сопоставления получаемых масс-спектров белков с обширнойбазой данных. На начало 2018 года база Biotyper составляет более 2500 видов микроорганизмов.

Объясните в двух словах: что делает масс-спектрометр?

Как следует из названия – масс-спектрометр прибор, измеряющий массу вещества. Проще говоря, масс-спектрометр это очень точные и чувствительные весы, способные «взвешивать» различные молекулы, в частности, пептиды, белки, нуклеиновые и жирные кислоты.

 

Для того чтобы провести масс-спектрометрический анализ («взвешивание»), необходимо получить ионы (заряженные частицы) исследуемого вещества. MALDI - (МАЛДИ, матрично активированная лазерная десорбция и ионизация) – один из способов такой ионизации вещества. Он наилучшим образом подходит для исследования крупных био-полимеров, таких как белки.

 

Ниже приведено формальное определение: Масс-спектрометрия (MS) — метод исследования массы (или соотношения массы к заряду [m/z]) вещества посредством специальных воздействий электрических и магнитных полей на исследуемое вещество в ионизированной форме

Что такое MALDI-ToF? Это такой бренд?

Понятие масс-спектрометрии включает в себя достаточно большую группу приборов, основанных на различных принципах ионизации и разделения ионов вещества в полях, необходимых для получения масс-спектра.

Поскольку белки, пептиды, нуклеиновые кислоты являются тяжелыми полимерами со сложной структурой, то существуют определенные требования к ионизации и разделению биомолекул в полях:

 

–Сохранение целостности молекул при ионизации

Эффективное разделение ионов биомолекул в полях

–Ионизация должна носить предсказуемый характер

–Простая пробоподготовка

–Простая интерпретация данных 

 

Из множества систем получения ионов и их разделения, наилучшими образом отвечают заявленным характеристикам MALDI-ToF масс-спектрометры 

 

Для того чтобы конретизировать тип используемого метода, в названии прибора приводится своеобразная классификация масс-спектрометрии, упоминающая метод ионизации и метод разделения ионов.

 

Таким образом, MALDI-ToF подразумевает собой прибор, где и используется:

  • MALDI или МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация – система получения ионов из твердой фазы. Это метод «мягкой» ионизации твердого вещества,  обусловленный воздействием лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.
  • ToF – время-пролетный метод разделения ионов в вакууме (измерение скорости дрейфа частиц в специальной трубе)

 

Прибор слишком дорогой. Зачем его покупать, если можно обойтись автоматическим бактериологическим анализатором?

Действительно, наиболее доступная модификация MALDI масс-спектрометра Bruker Microflex LT/SH примерно в три раза дороже автоматического бактериологического анализатора. Однако детальный экономический анализ системы MALDI Biotyper демонстрирует более высокую рентабельность метода в сравнении с бак.анализаторами.

 

Даже если рассматривать исключительно экономическую составляющую метода, очевидно, что MALDI Biotyper имеет преимущество перед бак. анализатором. Выгода от использования MALDI Biotyper становится наиболее очевидной при наличии лабораторного потока от 300-500 анализов в неделю.  Ключевым фактором является стоимость реагентов  для масс-спектрометрической идентификации МО, которые в 50-100 раз (!) дешевле по сравнению наборами для бактериологических анализаторов. Таким образом, с каждым последующим анализом экономическая выгода становится все более очевидной. Окупаемость анализатора Microflex LT при потоке около 500 анализов в неделю составляет один год. Это позволяет в дальнейшем значительно сэкономить на реагентной базе в последующие периоды.

 

Но, безусловно, методические выгоды от использования MALDI Biotyper превосходят экономические. Производительность лаборатории при использовании метода значительно возрастает. Появляется возможность увеличения пиковой нагрузки лаборатории до 1500 идентификаций в день (прибор затрачивает всего 30-40 минут на идентификацию 95 образцов МО).

 

MALDI Biotyper изменяет саму культуру работы в бактериологической лаборатории. Исследователю становится доступно использование уже первичного посева для идентификации МО, без необходимости дополнительно пересева и ожидания лишних суток роста. Прямая идентификация положительных гемокультур позволяет на сутки раньше начать лечение больных с сепсисом. Дополнительные базы по мицелиальным грибам и микобактериям позволяют точно идентифицировать традиционно сложные для анализа микроорганизмы. Лаборанту становится доступна возможность анализа смесей из двух разнородовых культур.

Безусловным достоинством метода является высокая точность самой идентификации, сравнимая с секвенированием последовательности 16S рРНК.

 

Ниже приводим обобщенные сравнительные характеристики работы с бак.анализатором и MALDI Biotyper

 

 Таблица 1. Сравнительная характеристика эффективность использования масс-спектрометра с системой MALDI Biotyper и автоматического бак.анализатора

Прибор

MALDI Biotyper (Microflex LT)

Бак.анализатор

Используемый образец

первичный посев

вторичный посев (пересев)

Скорость идентификации образца после загрузки в прибор

60-90 секунд

6-8 часов

Время идентификации от получения первичного образца

 около суток

около 2-3 суток

Идентификация МО из первичного материала

моча, ликвор, положительные гемокультуры

нет

Точность идентификации относительно 16S рРНК

98-95%

85-75%

Возможность идентификации смешанной культуры

одновременная идентификация смеси 2х культур разнородовых МО

нет

Особые возможности

идентификация микобактерий, дрожжевых и мицелиальных грибов

определение антибиотико-резистентности МО

Максимальная производительность  прибора за рабочий день (8часов)

1600 идентификаций МО

96 идентификаций МО

Стоимость реагентов для одной идентификации

3-5 рублей

600-800 рублей

Полная стоимость идентификации МО ( с учетом 100% амортизации прибора при потоке 500 анализов в неделю) за 3/5* лет

180/110* рублей

700/900* рублей

Всего 5 рублей за одну идентификацию? Что-то не верится! Чем достигается такая низкая стоимость?

Низкая себестоимость анализа достигается путем простого протокола прободготовки.

Метод предусматривает нанесение материала из единичной колонии микроорганизма. Из реактивов для анализа используются только раствор «матрицы» для масс-спектрометрии (раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты или HCCA).

 

Для одного анализа потребуется 1-2 мкл матричного раствора в концентрации 10 мг НССА/мл, т.е

0,01мг НССА. Таким образом, фирменной упаковки НССА, содержащей 1 грамм вещества хватит на 100 тысяч анализов. Это соответствует стоимости около одного рубля (!) на образец, с учетом стоимости растворителя.

 

Для увеличения достоверности анализа системы Biotyper используется «калибровочный бактериальный стандарт». Стандарт представляет собой смесь белков E.coli DH5α, с добавлением двух белков крупной массы. Калибровка происходит в диапазоне масс от 4 до 17 кДа. Стандарт необходимо вносить в одну из 96 точек на мишени. Упаковка стандарта стоимостью 925 Евро рассчитана 200 чипов формата 96. Это добавляет около 4 рублей к стоимости единичного анализа.

 

Таким образом, стоимость реагентов для прямой MALDI идентификации составляет около 5 рублей (!) за одну идентификацию.

Остальная стоимость анализа складывается из простого лабораторного пластика, такого как одноразовые петли и типсы для дозаторов. 

 

Еще раз отметим, что в масс-спектрометрах Bruker используется МНОГОРАЗОВАЯ стальная мишень (чип), которая НЕ ЯВЛЯЕТСЯ расходным материалом.

Не секрет, что существуют близкие приборы, использующие одноразовые стеклянные подложки в качестве MALDI мишеней. Такой подход значительно увеличивает себестоимость анализа, не улучшая его достоверности или качества.

Какое дополнительное оборудование необходимо для полноценной работы на MALDI Biotyper?

Как уже было сказано, пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа проста.

Лаборанту лишь нужно нанести колонию с чашки на мишень и добавить раствор матрицы. Для этой процедуры необходимы только петли и дозатор позволяющий добавлять 2мкл с соответствующими наконечниками.

Для облегчения и ускорения повседневной работы, мы рекомендуем использовать электронный дозатор с функцией многократной порционной выдачи объема 1-2 мкл.

 

Для максимально увеличения сроком хранения, HCCA матрица поставляется в исследовательскую лабораторию в виде сухого кристаллического порошка. Лаборанту необходимо один раз в 1-2 недели приготовить раствор матрицы. Процедура требует наличия набора дозаторов соответствующего объема и миницентрифуга-вортекс.

Факультативно, для соблюдения точности протокола мы также рекомендуем использовать аналитические весы с точностью до 0.1 мг для дозировки кристаллической матрицы. Отвес кристаллов удобнее производить тонким химическим шпателем.

 

В некоторых случаях (около 5% от всей работы) исследователю понадобится провести процедуру дополнительной экстракции белков из колонии микроорганизмов. Процедура проста и занимает не более 15-20 минут. Для этого потребуется наличие лабораторной центрифуги на 12 000 g для микропробирок 1.5 мкл.

 

По окончании работы с системой MALDI Biotyper, лаборанту потребуется помыть стальную мишень с нанесенными образцами. Для удобства выполнения этой процедуры мы рекомендуем иметь стальную или стеклянную емкость диаметром ~100 мм  и высотой  ~50 мм

 

Общий список дополнительного оборудования выглядит следующим образом:


Оборудование

Рекомендуемый производитель

Центрифуга для микропробирок 12000g

Microspin 12, SIA Biosan или аналог

Миницентрифуга-Вортекс

MSC-3000, SIA Biosan или аналог

Аналитические весы с точностью не менее 0.1 мг

Sartorius TE64, или аналог

Механический дозатор объемом от 0.2 мкл

Дозатор mLINE 0.1-3 мкл, Biohit, или аналог

Механический дозатор объемом до 20 мкл

Дозатор mLINE 2-20 мкл, Biohitили аналог

Механический дозатор объемом до 100 мкл

Дозатор mLINE 20-200 мкл, Biohitили аналог

Механический дозатор объемом до 1000 мкл

Дозатор mLINE 100-1000 мкл , Biohitили аналог

Электронный дозатор, имеющий шаг 0,2-2 мкл

Дозатор eLINE 0.2-10 мкл, Biohitили аналог

Металический шпатель для точного забора порошков из пробирок

Шпатель двухсторонний микро,

лопатка 40х3 мм, длина 150 мм, нержавеющая сталь, Bochem

Химический стакан, 250 мл

любого производителя

Стеклянный или металлический резервуар для чистки мишеней MALDI (Ø ~100 мм, высота ~50 мм)

любого производителя

Штатив-рабочее место для 1.5 мл и 0.2 мл пробирок

любого производителя

 

Какие расходные материалы необходимы для работы с MALDI Biotyper?

Одним из ключевых преимуществ системы MALDI Biotyper является небольшое количество и дешевизна расходных материалов, необходимых в повседневной рутинной практике.

 

Для прямой идентификации используется:

  • Одноразовая пластиковая бактериологическая петля объемом 1 мкл для забора колонии с чашки и нанесения ее на стальную мишень (чип). 
  • Заранее приготовленный раствор матрицы, наносимый в объеме 1-2 мкл с использованием дозатора и соответствующего наконечника.
  • И калибровочный стандарт, представляющий собой белки E.Coli, наносимый также в объеме 1-2 мкл на одну из 96-48-24 позиций мишени (чипа).

Дополнительные расходные материалы для MALDI Biotyper необходимы в двух основных случаях:

  • Приготовление раствора матрицы и калибровочного стандарта
  • Проведение процедуры дополнительной экстракции белков микроорганизмов для повышения точности идентификации

Ниже приведен список химических реагентов которые могут понадобиться в повседневной работе:

 

Реагенты

Рекомендуемый производитель

α-циано-4-гидроксикоричная кислота, фасованная

HCCA portioned, # 8255344, Bruker Daltonics

Бактериальный стандарт

Bruker Bacterial Test Standard # 8255343 , Bruker Daltonics

Ацетонитрил хроматографической чистоты

Ацетонитрил ≥ 99.9%, LC-MS CHROMASOLV® grade - Fluka (# 34967, Sigma-Aldrich GmbH)

Ультрачистая вода

ddH2O CHROMASOLV® for HPLC (#270733, Sigma-Aldrich GmbH)

Этанол  хроматографической чистоты

Этанол ≥ 99.8% (GC), (неденатурированный) (# 24102, Sigma-Aldrich GmbH)

Муравьиная кислота

Муравьиная кислота ~ 98% (T) (# 06440, Sigma-Aldrich GmbH)

Трифторуксусная кислота

TFA > 98.5% (# T62200, Sigma-Aldrich GmbH)

 

Список расходных материалов:

 

  • Бактериологические петли для забора и нанесения на чип колоний микроорганизмов объемом 1 мкл
  • Типсы для дозаторов соответствующего объема
  • Салфетки безволоконные (например, Kimwipes EX-L, KimTech Science)
  • Латексные или нитриловые перчатки без талька

Мне кажется, что масс-спектрометрия слишком сложный метод. Я боюсь что не освою это!

Как и все современные инновационные методы, масс-спектрометрия сперва может вызывать непонимание и опасение из-за непривычности подхода. В действительности, у рядового пользователя MALDI Biotyper не возникает необходимости погружаться в тонкости принципа действия или физических основ функционирования прибора. MALDI Biotyper управляется с помощью программы с интуитивно понятным интерфейсом на персональном компьютере под управлением привычной ОС Windows.

Как показывает многократный опыт обучения пользователей ранее не знакомых с масс-спектрометрией, система осваивается любым лаборантом за 1-2 дня.

Какой размер базы микроорганизмов у MALDI Biotyper?

На начало 2018 года размер базы Biotyper составляет более 2500 видов микроорганизмов. Стоит отметить, что Bruker активно пополняет базу Biotyper. Так, еще 5 лет назад база имела записи о 1300 МО, а в начале 2012 в базе было 700 видов МО.

 

Кроме того, дополнительно  доступны базы по туберкулезным и нетуберкуленым микобактериям (более 160 видов), а также мицелиальным и дрожжевым грибам (150 видов)