Частые вопросы

MALDI Biotyper – программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-ToF масс-спектрометров серии FLEX производства Bruker (например, Microflex, Autoflex ).

Метод выявляет уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов – своеобразный «отпечаток пальца». Идентификация микроорганизма происходит в основном по рибосомальным белкам, которые встречаются во всех микроорганизмах.

Биоинформационная модель, основанная на анализе белков, позволяет надёжно и точно проводить идентификацию конкретного микроорганизма до вида путём сопоставления получаемых масс-спектров белков с обширной базой данных. На начало 2019 года база Biotyper составляет более 2700 видов микроорганизмов.

Как следует из названия – масс-спектрометр прибор, измеряющий массу вещества. Проще говоря, масс-спектрометр это очень точные и чувствительные весы, способные «взвешивать» различные молекулы, в частности, пептиды, белки, нуклеиновые и жирные кислоты.

Для того чтобы провести масс-спектрометрический анализ («взвешивание»), необходимо получить ионы (заряженные частицы) исследуемого вещества. MALDI - (МАЛДИ, матрично активированная лазерная десорбция и ионизация) – один из способов такой ионизации вещества. Он наилучшим образом подходит для исследования крупных био-полимеров, таких как белки.

Ниже приведено формальное определение: Масс-спектрометрия (MS) — метод исследования массы (или соотношения массы к заряду [m/z]) вещества посредством специальных воздействий электрических и магнитных полей на исследуемое вещество в ионизированной форме

Понятие масс-спектрометрии включает в себя достаточно большую группу приборов, основанных на различных принципах ионизации и разделения ионов вещества в полях, необходимых для получения масс-спектра.

Поскольку белки, пептиды, нуклеиновые кислоты являются тяжелыми полимерами со сложной структурой, то существуют определенные требования к ионизации и разделению биомолекул в полях:

–Сохранение целостности молекул при ионизации

–Эффективное разделение ионов биомолекул в полях

–Ионизация должна носить предсказуемый характер

–Простая пробоподготовка

–Простая интерпретация данных 

Из множества вариантов получения и разделения ионов MALDI-ToF масс-спектрометры наилучшими образом отвечают заявленным характеристикам.

Для указания типа используемого метода в названии прибора приводится своеобразная классификация масс-спектрометрии, указыващая на метод ионизации и метод разделения ионов.

Таким образом, MALDI-ToF подразумевает собой прибор, где и используется:

• MALDI или МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация – система получения ионов из твердой фазы. Это метод «мягкой» ионизации сухого вещества,  обусловленный воздействием лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.
• ToF – время-пролетный метод разделения ионов в вакууме (измерение скорости дрейфа частиц в специальной трубе)

Действительно, наиболее доступная модификация MALDI масс-спектрометра Bruker Microflex LT/SH примерно в три раза дороже автоматического бактериологического анализатора. Однако детальный экономический анализ системы MALDI Biotyper демонстрирует более высокую рентабельность метода в сравнении с бак.анализаторами.

Даже если рассматривать исключительно экономическую составляющую метода, очевидно, что MALDI Biotyper имеет преимущество перед бак. анализатором. Выгода от использования MALDI Biotyper становится наиболее очевидной при наличии лабораторного потока от 300-500 анализов в неделю.  Ключевым фактором является стоимость реагентов  для масс-спектрометрической идентификации МО, которые в 50-100 раз (!) дешевле по сравнению наборами для бактериологических анализаторов. Таким образом, с каждым последующим анализом экономическая выгода становится все более очевидной. Окупаемость анализатора Microflex LT при потоке около 500 анализов в неделю составляет один год. Это позволяет в дальнейшем значительно сэкономить на реагентной базе в последующие периоды.

Но, безусловно, методические выгоды от использования MALDI Biotyper превосходят экономические. Производительность лаборатории при использовании метода значительно возрастает. Появляется возможность увеличения пиковой нагрузки лаборатории до 1500 идентификаций в день (прибор затрачивает всего 30-40 минут на идентификацию 95 образцов МО).

MALDI Biotyper изменяет саму культуру работы в бактериологической лаборатории. Исследователю становится доступно использование уже первичного посева для идентификации МО, без необходимости дополнительно пересева и ожидания лишних суток роста. Прямая идентификация положительных гемокультур позволяет на сутки раньше начать лечение больных с сепсисом. Дополнительные базы по мицелиальным грибам и микобактериям позволяют точно идентифицировать традиционно сложные для анализа микроорганизмы. Лаборанту становится доступна возможность анализа смесей из двух разнородовых культур.

Безусловным достоинством метода является высокая точность самой идентификации, сравнимая с секвенированием последовательности 16S рРНК.

Ниже приводим обобщенные сравнительные характеристики работы с бак.анализатором и MALDI Biotyper

 Таблица 1. Сравнительная характеристика эффективность использования масс-спектрометра с системой MALDI Biotyper и автоматического бак.анализатора

Низкая себестоимость анализа достигается путем простого протокола прободготовки.

Метод предусматривает нанесение материала из единичной колонии микроорганизма. Из реактивов для анализа используются только раствор «матрицы» для масс-спектрометрии (раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты или HCCA).

Для одного анализа потребуется 1 мкл матричного раствора в концентрации 10 мг НССА/мл. Таким образом, фирменной упаковки НССА, содержащей 1 грамм вещества хватит на 100 тысяч анализов. Это соответствует стоимости около одного рубля (!) на образец, с учетом стоимости растворителя.

Для увеличения достоверности анализа системы Biotyper используется «калибровочный бактериальный стандарт». Стандарт представляет собой смесь белков E.coli DH5α, с добавлением двух белков крупной массы. Калибровка происходит в рабочем диапазоне масс. Стандарт необходимо вносить в одну из 96 точек на мишени, что соответствует доли в 4 рублей от стоимости единичного анализа.

Таким образом, стоимость реагентов для прямой MALDI идентификации составляет около 5 рублей (!) за одну идентификацию.

Остальная стоимость анализа складывается из простого лабораторного пластика, такого как одноразовые петли и типсы для дозаторов. 

Еще раз отметим, что в масс-спектрометрах Bruker используется МНОГОРАЗОВАЯ стальная мишень (чип), которая НЕ ЯВЛЯЕТСЯ расходным материалом.

Не секрет, что существуют близкие приборы, использующие одноразовые стеклянные подложки в качестве MALDI мишеней. Такой подход значительно увеличивает себестоимость анализа, не улучшая его достоверности или качества.

Как уже было сказано, пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа проста.

Лаборанту лишь нужно нанести колонию с чашки на мишень и добавить раствор матрицы. Для этой процедуры необходимы только петли и дозатор позволяющий добавлять 2мкл с соответствующими наконечниками.

Для облегчения и ускорения повседневной работы, мы рекомендуем использовать электронный дозатор с функцией многократной порционной выдачи объема 1-2 мкл.

Для максимально увеличения сроком хранения, HCCA матрица поставляется в исследовательскую лабораторию в виде сухого кристаллического порошка. Лаборанту необходимо один раз в 1-2 недели приготовить раствор матрицы. Процедура требует наличия набора дозаторов соответствующего объема и миницентрифуга-вортекс.

Факультативно, для соблюдения точности протокола мы также рекомендуем использовать аналитические весы с точностью до 0.1 мг для дозировки кристаллической матрицы. Отвес кристаллов удобнее производить тонким химическим шпателем.

В некоторых случаях (около 5% от всей работы) исследователю понадобится провести процедуру дополнительной экстракции белков из колонии микроорганизмов. Процедура проста и занимает не более 15-20 минут. Для этого потребуется наличие лабораторной центрифуги на 12 000 g для микропробирок 1.5 мкл.

По окончании работы с системой MALDI Biotyper, лаборанту потребуется помыть стальную мишень с нанесенными образцами. Для удобства выполнения этой процедуры мы рекомендуем иметь стальную или стеклянную емкость диаметром ~100 мм  и высотой  ~50 мм

Общий список дополнительного оборудования выглядит следующим образом:

Одним из ключевых преимуществ системы MALDI Biotyper является небольшое количество и дешевизна расходных материалов, необходимых в повседневной рутинной практике.

Для прямой идентификации используется:

• Одноразовая пластиковая бактериологическая петля объемом 1 мкл для забора колонии с чашки и нанесения ее на стальную мишень (чип). 
• Заранее приготовленный раствор матрицы, наносимый в объеме 1-2 мкл с использованием дозатора и соответствующего наконечника.
• И калибровочный стандарт, представляющий собой белки E.Coli, наносимый также в объеме 1-2 мкл на одну из 96-48-24 позиций мишени (чипа).

Дополнительные расходные материалы для MALDI Biotyper необходимы в двух основных случаях:

• Приготовление раствора матрицы и калибровочного стандарта
• Проведение процедуры дополнительной экстракции белков микроорганизмов для повышения точности идентификации

Ниже приведен список химических реагентов которые могут понадобиться в повседневной работе:

Список расходных материалов:

• Бактериологические петли для забора и нанесения на чип колоний микроорганизмов объемом 1 мкл
• Типсы для дозаторов соответствующего объема
• Салфетки безволоконные (например, Kimwipes EX-L, KimTech Science)
• Латексные или нитриловые перчатки без талька

Как и все современные инновационные методы, масс-спектрометрия сперва может вызывать непонимание и опасение из-за непривычности подхода. В действительности, у рядового пользователя MALDI Biotyper не возникает необходимости погружаться в тонкости принципа действия или физических основ функционирования прибора. MALDI Biotyper управляется с помощью программы с интуитивно понятным интерфейсом на персональном компьютере под управлением привычной ОС Windows.

Как показывает многократный опыт обучения пользователей ранее не знакомых с масс-спектрометрией, система осваивается любым лаборантом за 1-2 дня.

На начало 2018 года размер базы Biotyper составляет более 2500 видов микроорганизмов. Стоит отметить, что Bruker активно пополняет базу Biotyper. Так, еще 5 лет назад база имела записи о 1300 МО, а в начале 2012 в базе было 700 видов МО.

Кроме того, дополнительно  доступны базы по туберкулезным и нетуберкуленым микобактериям (более 160 видов), а также мицелиальным и дрожжевым грибам (150 видов)